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PCR/qPCR耗材選擇的幾個(gè)主要因素!
1.塑料耗材組成：
材料
PCR/qPCR耗材通常由聚丙烯制成，因?yàn)樗嵌栊缘牟⑶夷軌虺惺軣嵫h(huán)過(guò)程中溫度的快速變化。 聚丙烯的惰性性質(zhì)使其對(duì)于反應(yīng)物質(zhì)的吸收降低至最小，確保獲取最佳的PCR結(jié)果。為了進(jìn)一步保障在純度和生物兼容性方面的批次間一致性，應(yīng)當(dāng)在生產(chǎn)過(guò)程中使用全新未循環(huán)使用的醫(yī)學(xué)級(jí)或分子生物學(xué)級(jí)高品質(zhì)聚丙烯原料。請(qǐng)注意，某些PCR / qPCR板邊框用更強(qiáng)的聚碳酸酯制成，以與高通量機(jī)器人應(yīng)用兼容。
顏色
PCR管和板通常可提供多種不同的顏色形式，以便于對(duì)于樣品的視覺(jué)區(qū)分和鑒別，特別是在高通量實(shí)驗(yàn)中。盡管塑料的顏色對(duì)DNA擴(kuò)增沒(méi)有影響，但在設(shè)置實(shí)時(shí)PCR或qPCR的反應(yīng)時(shí)，與透明耗材相比，我們更推薦使用白色塑料或磨砂耗材，以實(shí)現(xiàn)靈敏和準(zhǔn)確的熒光檢測(cè)(圖43)。
白色耗材通過(guò)阻止熒光折射出管來(lái)提高qPCR數(shù)據(jù)的靈敏度和一致性。折射被最小化時(shí)，更多的信號(hào)被反射回檢測(cè)器，從而增加信噪比。此外，白色管壁可阻止熒光信號(hào)傳遞至PCR儀模塊，避免被吸收或不一致地反射熒光信號(hào)，從而使重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的差異降至。由于每個(gè)品牌儀器的設(shè)計(jì)不同，請(qǐng)遵循廠家建議以獲得最佳性能。比如，對(duì)于Bio-Rad和Roche品牌的定量?jī)x器，推薦使用白色耗材用于qPCR。而對(duì)于Applied Biosystems熒光定量PCR儀，推薦使用磨砂孔耗材。
PCR/qPCR塑料耗材要點(diǎn)：
PCR/qPCR塑料耗材可提供多種規(guī)格和形式。了解他們相應(yīng)的特點(diǎn)和相關(guān)術(shù)語(yǔ)將會(huì)幫助您在使用這些塑料耗材時(shí)獲得最佳的PCR和qPCR結(jié)果。
一般屬性
反應(yīng)規(guī)模或加樣體積
PCR/qPCR塑料耗材的加樣體積決定了可成功進(jìn)行的PCR/qPCR反應(yīng)的規(guī)模(體積)。過(guò)量的加樣將會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)的效率下降，溢出以及交叉污染。另一方面，加樣不足則會(huì)導(dǎo)致樣品因蒸發(fā)而損耗。加熱模塊也決定了可使用的塑料耗材尺寸以及它們對(duì)于完整而有效熱傳導(dǎo)的最佳適配性。PCR/qPCR耗材的最常見體積規(guī)格為：
管：0.5 mL, 0.2 mL, 0.1 mL
96 孔板：0.2 mL, 0.1 mL
384 孔板：0.02 mL
裙邊：
PCR / qPCR板的“裙"是板周圍的板。裙邊可為反應(yīng)體系構(gòu)建時(shí)的移液過(guò)程提供較好的穩(wěn)定性，以及在進(jìn)行自動(dòng)機(jī)械處理時(shí)提供更好的機(jī)械強(qiáng)度。PCR / qPCR平板可分為無(wú)裙邊，半裙邊和全裙邊。
無(wú)裙邊板缺少周圍的面板。這種形式的反應(yīng)板可與絕大多數(shù)PCR儀和實(shí)時(shí)PCR儀的模塊適配，但不適用于自動(dòng)化應(yīng)用。
半裙邊板在板的邊緣周圍具有短的邊緣,在移液過(guò)程中提供足夠的支撐并且為機(jī)器人處理提供機(jī)械強(qiáng)度。
全裙邊的 PCR / qPCR板具有覆蓋板高度的邊緣面板.這種板形式適用于具有突出模塊的PCR儀(可有利于自動(dòng)化操作)，可安全穩(wěn)固適配。
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